二代测序在临床应用需要注意什么？
“美国纽约东北部的撒拉纳克湖畔，镌刻着西方一位医生特鲁多的铭言：有时去治愈，常常去帮助，总是去安慰。
而中国医生的墓志铭是什么呢：
“初从文，三年不中
后习武，校场发矢
中鼓吏，逐之出
遂学医，有所成
自撰一良方，服之，卒
”两个段子，是过去中西方医生截然不同的理念，而现在医学理念也越来越融贯中西。这是施毅教授近日在年中华医学会呼吸病学年会暨第二十次全国呼吸病学学术会议上精彩演讲的开篇，本次会议在江城武汉举行，汇聚了全国各地呼吸病学专家，为大家带来学术盛宴。而施教授一席有趣生动又“有料”的演讲更是赢得观众的喝彩，我们一起来看看吧！
01
老龄化社会带来严峻的感染现状
随着时代的变化，我们的社会也正在步入老龄化，过去我们对老人的标准是大于等于60岁，现在是大于等于65岁。而随着老龄化社会的变迁，变化的还有疾病谱。拿日本为例，日本老龄化带来的是老年人肺炎死亡率急速增加的后果，而在欧美国家，老年人死亡率第一的疾病是心脑血管疾病。那么感染性疾病的现状如何呢？
全球：
据WHO报道，感染性疾病导致患者死亡全部死因的25%以上，每年万儿童死于感染性疾病。
中国：
感染性疾病占所有疾病的50%以上，造血系统肿瘤患者75%死于感染，实体肿瘤患者50%死于感染。
感染性疾病是人类头号杀手，是导致儿童死亡第一位的原因。抗生素的使用，使疾病得以控制，也使病原产生耐药性，甚至形成超级细菌。
在感染性疾病诊断中，诊断、治疗和预防是三个关键环节。然而众多危重感染无法准确诊断，例如：30%-50%的肺炎致病原因不明，40%-60%的关节炎致病原因不明。
感染性疾病也给患者带来沉重的疾病负担，那么在如此严峻的现状下，有两个问题摆在临床医生面前：能确认是感染吗？能找到病原体吗？问题摆在眼前，促进感染性疾病的诊疗也成了众多专家努力的方向，宏基因组二代测序（mNGS）应运而生。
02
什么是宏基因组二代测序
所谓宏基因组二代测序，是不基于培养，直接从环境/临床样品中提取全部微生物的DNA，利用基因组学的研究策略研究环境样品中所包含的全部微生物的遗传组成及其群落功能，可广泛分析临床样本微生物组（细菌、真菌、病*）的高通量测序方法。
传统的检测方法在敏感性，特异性，时效性，信息量等方面存在局限，而且对于未知或者罕见的病原微生物，无法快速识别。而mNGS从取样，核酸提取及建库到测序、生信分析及报告，整个过程约24小时。
目前该技术已经纳入的病原体有多种，其中包括余种细菌，余种病*，余种真菌和种寄生虫，为疑难危重症及罕见病原微生物感染的诊断提供了有效的技术手段。
年，mNGS走入大众视野，新英格兰医学杂志（NEJM）刊登了一则病例：
14岁联合免疫缺陷综合征男孩，年波多黎各旅行回国后因脑膜炎住院，发展为脑积水和癫痫状态。6周内进行38项感染病原检测，先后联用5种抗菌药物，未查出病因，尝试按照自免脑引起的昏迷状态治疗。48小时脑脊液宏基因组测序，检出圣地罗西钩端螺旋体序列条，改用青霉素治疗，32天后男孩痊愈出院。
NEJM主编评论该报告的标题为“NGS，一个病例如何改变世界”，可见NGS的重要意义。
随后，mNGS迅速被临床认可，年美国FDANGS感染性疾病诊断策略提出，mNGS可以用于微生物鉴定，检测是否耐药，是否是*力标志物。
目前，病原体高通量测序的临床适应症包括：
疑难：不明原因感染诊断，病因排查；
危重：重症肺炎、脑膜炎、脓*症等；
特殊：免疫低下人群，如移植患者、肿瘤患者等。
mNGS的技术正随着社会的发展，在不断进步、完善。
可适用的感染类型和可送检的标本（图）
03
正确认识mNGS技术的局限和挑战
与传统病原微生物检测相比，mNGS敏感性高，信息量大，但也存在一定的局限性。因此，施教授也通过几个问题，为大家带来新的认识。
1mNGS结果解读应注意什么？检出的病原体：
检出的病原体只能代表标本中存在这些检出微生物，但不能确定是定植菌、背景菌还是致病菌。
胞内菌/真菌检出率低：
胞内感染菌因释放到体液中含量较少而导致检测敏感性偏低。另外，具有较厚细胞壁的病原体，其核酸提取效率较低，导致检出率和敏感性较低。
RNA病原体的检测：
RNA转录本身有更高的丰度和复杂度，又容易降解，对运输和保存的要求较高，因此RNA病*的临床检测还存在一定的困难。
可靠程度：
不同的公司，对于可靠程度的数据采用不同的报告方法，如深度、覆盖度、丰度、估测浓度、置信度，各有千秋，需要统一。
最重要的参数需谨记：病原体，序列数。
2rads数的高与低意味着什么？rads指的是匹配到该病原体的序列数目，rads高不一定意味着致病，rads数低不一定意味着不致病，数的多少与标本中病原体含量多少、标本中核酸提取量及标本中人源序列比例有关。
不同的病原体，具有不同的rads数特点，单个病原体逐个分析至关重要。结合rads数目、病原体排位，临床才能更好的进行分析。
3合理报告，注意区分背景菌老年男性，因“流感”1周入住呼吸ICU，PCR确诊重症甲流肺炎，治疗好转，第5天再次发热，病情加重，考虑继发曲霉感染，经验性抗曲霉治疗。诊断是否成立？经验性治疗合理吗？
检查GM试验，血清GM3.81，BALFGM4.34，高度拟诊，但所有标本培养无真菌生长。此时BALFmNGS结果汇报，检测到烟曲霉，诊断成立，继续治疗痊愈。
因此，mNGS报告时要注意以下三个要点：是否是致病病原体或条件致病病原体；人体正常存在微生物，在免疫缺陷等特殊患者中值得